د نجلاء عباس تكتب: طرق الكشف عن البكتيريا القابلة للحياة وغير قابلة للإستزراع

باحث – معهد بحوث الصحة الحيوانية الفرعى – طنطا – مركز البحوث الزراعية – مصر

مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء عن طريق المياه أو الغذاء الملوث  قد تشكل  تهديدات  لسلامة الأغذية وبالتالى قد تتسبب في حدوث مخاطر عديدة لصحة الانسان ومن امثلة هذه المسببات الاشيريشيا كولاي   O157 وستاف اوريوس الايجابي لتجمع البلازما والسالمونيلا المعوية والليستيريا مونوسيتوجينز ولذلك يجب مراقبة السلامة الميكروبيولوجية للمنتجات الغذائية المعملية المعتمدة  للكشف عن التلوث الميكروبي ولكن ثبت من خلال الابحاث العلمية أن العديد من البكتيريا تدخل في حالة كمون نتيجة الظروف البيئية الغير مواتية لنمو تلك الميكروبات ولكنها قد تنشط مرة اخرى اذا اصبحت الظروف مواتية لذلك ويطلق على حالة الكمون هذه مصطلح (VBNC state) وهى استراتيجية عامة لتكييف البكتيريا للبقاء على قيد الحياة في مختلف الظروف غير المواتية والمجهدة ولا يمكن اكتشاف هذه الخلايا بطرق الفحص التقليدية. ولكن لا تزال البكتيريا وهي فى حالة ( VBNC ) والملوثة للأغذية تشكل خطرًا على صحة المستهلكين حيث اثبتت العديد من الدراسات ان هناك أدلة على امكانية انتعاشها واستعادة وظائفها الحيوية وكذلك ضراوتها مرة اخرى عندما تتوفر ظروف أكثر ملاءمة و يكون لها القدرة علي إحداث العدوي وعدم قدرة الأختبارات التقليدية للكشف عنها لذلك فهي تمثل تحديا كبيرا لسلامة الغذاء والصحة العامة.

تعريف VBNC:–

هى البكتيريا في حالة كمون غير القابلة للزراعة على الاوساط البيئية المخصصة لنموها وهى استراتيجية من إستراتيجيات البقاء الفريدة للعديد من البكتيريا عند تعرضها لعوامل بيئية قاسية وتبدو كامنة لحين تحسن الظروف لتصبح ملائمة للنمو مرة اخرى او من خلال انعاشها (resuscitation) باستخدام اوساط بيئية مناسبة لانقسام الخلايا. هى بذلك لا تستجيب للفحص الميكروبيولوجي لأنها غير قادرة على تطوير مستعمرات مرئية على وسائط  الاستزراع البكتريولوجي التقليدية ،ولا تعتبرهذه الخلايا ميتة لان لها القدرةعلى النشاط الأيضي ولها غشاء  حيوى سليم يحتوي على معلومات وراثية غير تالفة بعكس الخلايا الميتة. وقد تسبب الاصابة بالامراض في ظل الظروف المناسبة.

• المسببات العديدة لدخول البكتيريا فى حالة  VBNC:

تتنوع عوامل الاجهاد (Stressful condition) التى تؤدي لخلل التوازن الطبيعي لنموالبكتيريا ما بين عوامل فيزيائية و اخرى كيميائة ومن امثلتها:

• عدم وجود العناصر الغذائية اللازمة لنمو البكتيريا. . Starvation
• درجات الحرارة المنخفضة.
• الاجهاد التاكسدي (oxidative stress ).
• المياة وما تحتوية من مواد مطهرة مثبطة للنمو Sea water, Deionized water and Chlorinated water .
• عوامل كيميائية (Chemical Agents) مثل هيدروجين بيروكسيد وايونات النحاس (CuSO4 ).
• معاملات غير حرارية: ومن امثلتها طرق التعقيم TiO2 photocatalysisاو plasma treatment .
• التركيزات الاسموزية والتغير الحاد في الرقم الهيدروجيني           .

• التطهير بالأشعة فوق البنفسيجية (radiation, as UV light )
• المواد الحافظة شائعة الاستخدام في مجال الصناعات الغذائية.
• المعادن الثقيلة.
• المياه المؤكسدة المحللة كهربائيا: وتستخدم كعامل مضاد للميكروبات وصديق للبيئة
• امثلة للبكتيريا التى تدخل فى حالة :VBNC

هناك عدد كبيرمن البكتيريا تسبب أمراض للأنسان والحيوان و ايضا تسبب  فساد الأغذية بجميع أنواعها و لديها القدرة على الدخول فى حالةVBNC و منها على سبيل المثال لا الحصر:

• السالمونيلا(Salmonella)  ومنها سالمونيلا تايفاى و تايفيميوريوم
• الاشيريشيا كولاي ((Escherichia coli
• الشيجيلا  مثل ديزينترى و شيجيلا فلاكسنيرى و شيجلا سوننيى
• ايرومونس هيدروفيلا Aeromonas hydrophila
• ليستيريا مونوسيتوجينز (Listeria monocytogens)
• كامبيلوباكترجيجوناي
• فيبرو بكتيريا مثل فيبرو باراهيموليتيكوس وفيبرو كوليرا.
• خصائص البكتيريا فى حالة VBNC: –
• لها قدرة عالية في الحفاظ علي سلامة الخلية maintaining apparent cell integrity
• لديها القدرة علي مقاومة المضادات الحيوية وذلك لإنخفاض نشاط التمثيل الغذائي وحالة الكمون
• لديها القدرة على النشاط الايضى بسبة منخفضة .( low metabolic activity)
• تتقزم (Showing dwarfing)
• لديها القدرة لانخفاض نقل المغذيات ( reduced nutrient transport).
• لها خاصية القدرة على اعادة نشاطها وضراوتها في جسم الكائن الحى
• تتميز بقدرتها على القيام بتعديلات كبيرة فى تكوين الاحماض الدهنية للاغشية السيتو بلازمية
• لديها القدرة على التعبير الجينى
• تمتلك بعض اشكال النشاط الخلوى القابل للقياس والبلازميد المحتفظة بها

 

• ما هو الانعاش (resuscitation)و كيفية حدوثه:

الانعاش هو قدرة خلايا البكتريا في حالةVBNC علي إستعادة النشاط الأيضي الطبيعي وتصبح قابلة للزراعة مرة أخري علي الوسائط البيئية المتخصصة. و يتم  ذلك بعدة طرق منها :

• بعض الحالات تتطلب فقط ازالة عوامل الاجهاد .
• اضافة بعض من مضادات الاكسدة مثل الكتاليز او بيروفات الصوديوم
• استخدام درجات الحرارة المناسبة لنمو البكتيريا
• اضافة بعض العناصر الغذائية (الميثيونين والجلوتامين والثريونين والسيرين والأسباراجين)
• تهيئة المحفزات البيولوجية حيث ان بعض الكائنات الحية تتطلب الحضانة في بيض الدجاج مثل  jejune
• الهدف من دراسة البكتيريا فى حالة VBNC:

و الهدف هو دحض المعتقد من الكثيرين بان البكتيريا فى حالة VBNCغير قادرة على  احداث العدوى و اعتبار عينات الغذاء والعينات السريرية خالية من البكتيريا اذا كانت نتائج الزراعة على الوسائط التقليدية سلبية فلذلك سيتم مناقشة تاثيرها على  الصحة العامة  وعلاقتها بصحة الغذاء كالتالى:

• اهمية الخلايا الحية وغير قابلة للاستزراع للصحة العامة:
• بعض الدراسات توصي باضافة خطوة اثناء الفحص المعملي للأغذية والمشروبات يكون الغرض منها اعادة انعاش Resuscitation الميكروبات الممرضة التي قد تكون في الغذاء في حال VBNC formيتم اختبارات دورية للكشف عن مسببات الامراض كما يجب البحث عن طرق اضافية اكثر منهجية للحد من تفشى مسببات الامراض عن طريق الأغذية.
• اظهرت بعض الدراسات ان الايشيريشيا كولاي وهي فى حالة VBNC تكون مقاومة للمضادات الحيوية مما تسبب فى اعادة العدوى و ظهور اصابات معوية.

 2 – اهمية الخلايا الحية وغير  قابلة للاستزراع في مجال سلامة الغذاء:

الأغذية والبيئة  حولها هى أنظمة بيئية معقدة ونظرا لأنها تخضع للحفظ و تتاثر بعوامل مختلفة تتعرض لها البكتيريا فى نفس الوقت مما يؤدي الى  حالة الكمون VBNC state وربما قد يحدث لها إنتعاش قبل إستهلاك الغذاء وبالتالي تؤدي إلي تفشي الأمراض وتهدد سلامة الغذاء منها:

• عوامل فيزيائية و كيميائية داخلية مثل:
  • الرقم الهيدرجينى PH))
  • النشاط المائى    a_W
  • التركيب الكيميائى للغذاء

• عوامل بيئية خارجية مثل:
  • درجات حرارة التخزين ووقت التعرض.
  • التعبئة و التغليف فى درجة حرارة جو مناسبة .
  • المعالجات المستخدمة كالمطهرات و غيرها.

و قد ثبت وجود  VBNC state فى حالات عدة منها على سبيل المثال:

• وجود الايشيريشيا كولاي فى عصير الجريب فروت و اللبن المبستر.

وجود سالمونيلا انتريكا فى حالة VBNC فى بعض الأغذية في اليابان.

• طرق الكشف عى البكتيريا فى حالة VBNC: يوجد العديد من الطرق منها:

• المجهر الضوئى:

و ذلك باستخدام حمض الناليديكسيك و الذى يوقف انقسام الخلايا ثم ترى بالميكروسكوب حيث تظهر خلاياVBNC بيضاوية الشكل و اكبر فى الحجم ،بينما  الخلايا الحية مستطيلة الشكل.

• المجهر الفلوروسنتي (Fluorescent Microscopy) :وتعتمد على التلوين الفلورى باستخدام الصبغات حيث تظهر خلايا VBNCباللون الاخضر او الاحمر او البنفسجى على حسب نوع الصبغة المستخدم.
• استخدام تقنية (Backlight Live/Dead assay) : حيث تظهر الخلايا الميتة كخلايا حمراء اللون ،بينما الخلايا الحية  لونها اخضر.
• التقنيات الجزيئية (Molecular Techniques): وخاصة تقنية  (RT-PCR) و الذى  يعتمد اساسا علي وجود mRNA في الخلايا القابلة للحياة وبالتالي يمكن استخدامه للتمييز بين البكتيريا الحية والميتة.
• طرق أخري متنوعة مثل (أجهزة الإستشعار الحيوية – التحليل الطيفي – قياس الطيف الكتلي).

 

 

في نهاية المقال نود ان نوضح انه نظرا لتعدد المخاطر الناتجة عن طريق تلوث الغذاء والماء بالبكتيريا الممرضة المنقولة فى حالة VBNC والتى تؤثر علي الصحة العامة وسلامة الغذاء لابد من الاخذ فى الاعتبار النقط التالية :-

• ضرورة اتباع أساليب دقيقة وطرق متطورة جديدة للكشف عن البكتيريا فى حالة VBNC .
• عمل ابحاث جديدة و متنوعة لدراسة العوامل والمحفزات التى تدخل البكتيريا فى حالة VBNC .
• التاكد من الإستئصال الناجح لمعظم مسببات الأمراض من خلال إستخدام تقنيات حديثة ومتطورة لمعالجة الأغذية.
• محاولة استكشاف تأثيرات النظم الغذائية المختلفة وظروف معالجة الغذاء مع ضرورة تطوير أدوات أكثر دقة وتنوعًا لتفادى حالة VBNC .

 

References: –

Oliver, JD.2010. “Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria,” FEMS Microbiology Reviews, vol. 34, no. 4, pp. 415–425, 2010.

Josephson, KL., Gerba, CP. and Pepper, IL.1993. “Polymerase chain reaction detection of nonviable bacterial pathogens,” Applied and Environmental Microbiology, vol. 59, no. 10, pp. 3513–3515, 1993.

Gunasekera, TS., Sørensen, A., Attfield, PV., Sørensen, SJ. and D. A. Veal, DA.2002. “Inducible gene expression by nonculturable bacteria in milk after pasteurization,” Applied and Environmental Microbiology, vol. 68, no. 4, pp. 1988–1993, 2002.

Tolba K, Basma A. Hendy and Noha M. El-Shinawy (2020): TRIAL FOR RESUSCITATION OF VIABLE BUT NON-CULTURABLE (VBNC) L. MONOCYTOGENES DUE TO THE EFFECT OF CHLORINE AND MAGNESIUM CHLORIDE (MGCL2) ON FOOD CONTACT SURFACE.  EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND MEDICAL RESEARCH, ejpmr, 2020,7(6), 20-28